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产品简介

Small RNA主要包括miRNA、piRNA、tsRNA(tRF&tiRNA)、snRNA和snoRNA等,是一类不具有蛋白编码能力的RNA分子,能调控基因表达,在细胞生长、发育和代谢等基础生物学过程中都扮演着重要的角色,甚至在癌症等相关疾病形成过程中也起着关键的作用。高通量测序技术省去了烦琐的Small RNA克隆文库构建过程,可以一次性生成上百万条Small RNA序列,能够快速鉴定特定条件下表达的已知Small RNA并发现新的Small RNA,同时还可以研究不同条件下Small RNA的表达差异,并可以联合转录组测序表达谱数据进行关联分析。

A workflow for Small RNA Sequencing

Jai PM et al., RNA Mapping, 2014

我们的优势

1. 针对动物(包括外泌体)Small RNA(miRNA、piRNA、tsRNA)提供定制化实验分析方案;

2. 不仅能高效准确发现并注释非模式物种新的miRNA,还能进行piRNA、tiRNA、tRF等最新的研究;

3. 及时更新miRBase、miRandaRNAhybrid等专业miRNA数据库以及靶基因预测算法,保证分析结果紧跟行业前沿。

样本要求

组织样品:

1. 动物组织:>200mg;

2. 植物组织:>200mg;

3. 细胞培养:>2x106个;

4. 全血:>3ml;

5. 菌体:>2x106个或>300mg。

RNA样品:

1. 请提供体积15 μL - 100 μL,总量≥10μg,浓度≥ 200ng/μL的RNA;

2. OD260/280介于1.8~2.2之间,OD260/230≥2.0,RIN≥6.5,28S:18S≥1.0,确保RNA无降解;

3. 送样时请标记清楚样品编号,管口使用Parafilm膜密封;

4. 样品保存期间切忌反复冻融;

5. 送样时请使用干冰运输。

不同样品之间存在差异,详情请向烈冰咨询

实验流程





1. RNA提取及质控:RNA总量 > 1 μg ;RIN> 6.0

2. RNA富集:切胶范围10-50bp

3. RNA质控:Agilent 2200质控

4. 文库构建:文库分子18-30bp

5. 上机测序:Small RNA测序NovaSeq、HiSeq、Ion Proton等测序仪都可以完成。测序数据量40M reads。

数据分析流程

>>动物小RNA






>>植物小RNA


结果示例

1、数据过滤对于原始数据进行质量控制,排除序列中的过短序列,低质量序列,未测出序列,并去掉双端接头序列,以保证测序数据的质量与准确性,我们将从碱基质量,GC含量等角度对测序数据进行质量评估,过滤后的数据称为Clean Data(过滤后数据)。



碱基质量结果图(过滤后)

注:横坐标表示碱基位点,纵坐标表示碱基质量值。




2、序列比对和长度分析由于Small RNA中成员较多,且各成员有各自的长度区间,我们首先会将测序得到的数据比对到分析物种的miRNA数据库中,再将unmapped reads比对到NCBI数据库中,对比对到不同数据库中的small RNA(miRNA、piRNA和tsRNA)序列进行长度分布统计,观察各类small RNA的长度分布情况以及主峰所在的位置。



small RNA长度分布情况

注:左图为miRNA长度分布图;右图为piRNA长度分布图。




3、碱基偏好性分析成熟的miRNA在首位往往就具有U的偏好性,同时来源于生殖细胞的piRNA,其首位也通常具有U偏好性。因此,在进行序列比对后,对于比对到不同数据库中的small RNA序列进行长度分布统计,观察各类small RNA的碱基偏好情况。



small RNA碱基偏好性分析

注:横坐标表示序列长度,纵坐标表示百分比,不同颜色表示不同的核苷酸。




4、表达量统计Small RNA测序最关键的步骤是对small RNA进行定量表达和差异筛选,将测序数据比对到各small RNA对应的数据库后,采用表达量统计软件对于每一个small RNA的Counts数进行标化。



miRNAs表达量统计分析

An X et al., Theriogenology, 2016

注:该表格列举了部分差异miRNAs的名称和序列信息,NE(normalized expression)表示标化后的miRNA表达量。