产品简介

Small RNA主要包括miRNA、piRNA、tsRNA（tRF&tiRNA）、snRNA和snoRNA等，是一类不具有蛋白编码能力的RNA分子，能调控基因表达，在细胞生长、发育和代谢等基础生物学过程中都扮演着重要的角色，甚至在癌症等相关疾病形成过程中也起着关键的作用。高通量测序技术省去了烦琐的Small RNA克隆文库构建过程，可以一次性生成上百万条Small RNA序列，能够快速鉴定特定条件下表达的已知Small RNA并发现新的Small RNA，同时还可以研究不同条件下Small RNA的表达差异，并可以联合转录组测序表达谱数据进行关联分析。

A workflow for Small RNA Sequencing

Jai PM et al., RNA Mapping, 2014

我们的优势

1. 针对动物（包括外泌体）Small RNA（miRNA、piRNA、tsRNA）提供定制化实验分析方案;

2. 不仅能高效准确发现并注释非模式物种新的miRNA，还能进行piRNA、tiRNA、tRF等最新的研究；

3. 及时更新miRBase、miRanda、RNAhybrid等专业miRNA数据库以及靶基因预测算法，保证分析结果紧跟行业前沿。

样本要求

组织样品：

1. 动物组织：>200mg；

2. 植物组织：>200mg；

3. 细胞培养：>2x10⁶个；

4. 全血：>3ml；

5. 菌体：>2x10⁶个或>300mg。

RNA样品：

1. 请提供体积15 μL - 100 μL，总量≥10μg，浓度≥ 200ng/μL的RNA；

2. OD260/280介于1.8~2.2之间，OD260/230≥2.0，RIN≥6.5，28S:18S≥1.0，确保RNA无降解；

3. 送样时请标记清楚样品编号，管口使用Parafilm膜密封；

4. 样品保存期间切忌反复冻融；

5. 送样时请使用干冰运输。

不同样品之间存在差异，详情请向烈冰咨询

实验流程

1. 总RNA提取及质控：RNA总量 > 1 μg ；RIN> 6.0

2. 小RNA富集：切胶范围10-50bp

3. 小RNA质控：Agilent 2200质控

4. 文库构建：文库分子18-30bp

5. 上机测序：Small RNA测序NovaSeq、HiSeq、Ion Proton等测序仪都可以完成。测序数据量40M reads。

数据分析流程

>>动物小RNA

结果示例

1、数据过滤对于原始数据进行质量控制，排除序列中的过短序列，低质量序列，未测出序列，并去掉双端接头序列，以保证测序数据的质量与准确性，我们将从碱基质量，GC含量等角度对测序数据进行质量评估，过滤后的数据称为Clean Data（过滤后数据）。

碱基质量结果图（过滤后）

注：横坐标表示碱基位点，纵坐标表示碱基质量值。

2、序列比对和长度分析由于Small RNA中成员较多，且各成员有各自的长度区间，我们首先会将测序得到的数据比对到分析物种的miRNA数据库中，再将unmapped reads比对到NCBI数据库中，对比对到不同数据库中的small RNA（miRNA、piRNA和tsRNA）序列进行长度分布统计，观察各类small RNA的长度分布情况以及主峰所在的位置。

small RNA长度分布情况

注：左图为miRNA长度分布图；右图为piRNA长度分布图。

3、碱基偏好性分析成熟的miRNA在首位往往就具有U的偏好性，同时来源于生殖细胞的piRNA，其首位也通常具有U偏好性。因此，在进行序列比对后，对于比对到不同数据库中的small RNA序列进行长度分布统计，观察各类small RNA的碱基偏好情况。

small RNA碱基偏好性分析

注：横坐标表示序列长度，纵坐标表示百分比，不同颜色表示不同的核苷酸。

4、表达量统计Small RNA测序最关键的步骤是对small RNA进行定量表达和差异筛选，将测序数据比对到各small RNA对应的数据库后，采用表达量统计软件对于每一个small RNA的Counts数进行标化。

miRNAs表达量统计分析

An X et al., Theriogenology, 2016

注：该表格列举了部分差异miRNAs的名称和序列信息，NE（normalized expression）表示标化后的miRNA表达量。